HPV (Papiloma Virus Uman) ADN – detecție și genotipare
Infecţia HPV este implicată în marea majoritate a cazurilor de cancer cervical. Pe baza potenţialului oncogen tipurile genitale de HPV sunt împărţite în tipuri cu risc scăzut şi tipuri cu risc crescut.
Tipurile HPV cu risc scăzut sunt asociate în mod caracteristic cu verucile genitale, în timp ce tipurile cu risc crescut sunt responsabile de apariţia cancerului invaziv.
În cadrul tipurilor oncogene de HPV, genotipul 16 determină peste 50% din cazurile de cancer cervical, iar 18 este implicat în 10-20% din cazuri. Uneori, infecția dispare de la sine, alteori poate cauza leziuni precanceroase sau cancer.
În ciuda faptului că ASCCP (American Society for Colposcopy and Cervical Pathology ), nu recomandă genotiparea HPV la pacientele cu citologie ASC-US – “celule scuamoase anormale de semnificaţie nedeterminată”, FDA a aprobat ca testul HPV pentru genotipurile 16/18 să fie folosit ca adjuvant în stabilirea evoluției bolii.
Un screening complet include: testul PAPANICOLAU și testul HPV ADN. Prin testul Papanicolau, normalitatea celulelor colului uterin este evaluata sub un microscop. Modificările de tip scăzut ce apar la celulele de pe frotiul Papanicolau pot indica o infecție cu HPV, dar nu există o distincție clară între modificările cu grad redus de risc și cele cu grad înalt.
Indicaţiile efectuării testului de genotipare sunt următoarele:
-monitorizarea evoluţiei infecţiei determinate de un anumit tip HPV
-monitorizarea persistenţei genotipurilor asociate cu risc crescut de cancer cervical, în special la pacientele cu citologie negativă;
-femei cu citologie ASC-US;
-monitorizarea eficienţei tratamentului în cazul leziunilor cervicale asociate cu HPV (conizaţie, radioterapie sau chimioterapie);
-genotiparea pre- şi postvaccinală în programe selecţionate de screening;
-Pentru femeile de peste 21 ani, atunci când rezultatele testului Papanicolau indică modificări anormale, care pot fi cauzate de un tip de HPV cu risc crescut, este necesară efectuarea testului HPV ADN, ca test de urmărire a evoluției bolii.
Recoltarea probelor
Nu este necesară o pregătire specială a pacientului. Recoltarea este făcută de către medicul specialist cu ajutorul periuței cervicale. Celulele cervicale sunt colectate în mediu lichid specific acestui test.
Pentru recoltarea probelor se recomandă o programare la medicii specializați pe obstretică-ginecologie din cadrul Policlinicii Bethesda: Dr. Stoica Mihaela – medic specialist, Dr. Pantea Mihaela – medic specialist, Dr. Bostan Georgiana – medic specialist.
Programările se pot face la numărul de telefon: 0230 551 566.
Stabilitate probă: proba este stabilă 30 de zile la 2-8 °C.
Frecvență: 1 dată pe săptămână
Rezultatele pot fi ridicate personal de la Policlinica Bethesda sau trimise pe adresa de e-mail. De asemenea, un rezultat pozitiv include comunicarea genotipurilor HPV prezente în probă.
Metodă – genotiparea și detecția genotipurilor HPV prin reacție de polimerizare în lanț (PCR).
Kitul folosit în cadrul Laboratorului de Biologie Moleculară Bethesda, permite detecția a 14 genotipuri HPV, dintre care amintim: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 și 68.
Există trei pași cheie pentru detecția genotipurilor HPVADN prin PCR:
a. colectarea probelor – de către medicul ginecolog
b. extracția
c. PCR
Primul pocedeu, după recoltarea probei constă în realizarea procesului de extracție utilizând aparatul ExiPrep™ 16 Dx de la Bioneer, care izolează materialul genetic din eșantion, inclusiv materialul genetic de la orice virus care ar putea fi prezent.
Pasul următor constă în etapa de PCR, care folosește substanțe chimice speciale și un aparat adecvat numită termociclator – Applied Biosystems QuantStudio 5, care provoacă o reacție ce produce milioane de copii dintr-o mică parte din materialul genetic al virusului. În timpul acestui proces, una dintre substanțele chimice produce o lumină fluorescentă dacă HPV ADN este prezent în probă. Această lumină fluorescentă este un „semnal” detectat de aparatul PCR și un software special este utilizat pentru a interpreta semnalul ca rezultat pozitiv al testului.
Sistemul RT-PCR Applied Biosystems QuantStudio 5 este conceput pentru utilizatorii care doresc performanțe superioare, versatilitate și opțiuni de securitate într-un sistem RT-PCR, accesibil și ușor de utilizat. Software-ul de proiectare și analiză optimizat este ideal pentru toți utilizatorii. Când este conectat la iConnect, platforma bazată pe cloud de la Thermo Fisher, sistemul QuantStudio 5 oferă acces la date oriunde și oricând doriți. Folosind tehnologia dovedită OptiFlex (cu șase canale decuplate și LED-uri albe) și cu șase zone de temperatură Veriflex independente, sistemul QuantStudio 5 cu 96 de godeuri permite o precizie ridicată și o sensibilitate îmbunătățită a datelor pentru o gamă largă de aplicații genomice10.
Caracteristicile sistemului QuantStudio 5 cu 96 de godeuri includ:
• Tehnologie OptiFlex dovedită (șase canale decuplate / 21 combinații de filtre cu LED alb) pentru rezultate de încredere
• Software-ul securizat bazat pe cloud oferă accesibilitate sporită și opțiuni de stocare
• Software-ul instrumentului este simplificat prezentând ecran tactil interactiv pentru o utilizare simplificată10.
Aplicația prezintă o versatilitate ridicată astfel încât protocoalele sunt simple și optimizate, testele și reactivii fiabili și software-ul intuitiv
Un rezultat pozitiv sugerează prezența HPV ADN în proba supusă analizei. Corelația clinică cu istoricul pacientului și alte informații diagnostice este foarte recomandată pentru a determina starea pacientului. Un rezultat nedetectabil (negativ) indică absența în proba analizată a acidului nucleic specific. În ciuda unui rezultat negativ, nu este exclusă prezența unei infecții, având în vedere calitatea probei prelevate, modul de păstare al acesteia, precum și vârsta pacientei și stadiul infecției. Rezultatele negative trebuie analizate în raport cu observațiile clinice și cu istoricul pacientului.
Prezența unor inhibitori ai reacției RT-PCR poate conduce la apariția unui rezultat invalid, observabil prin lipsa amplificării controlului intern. Într-o astfel de situație se recomandă repetarea testului. În cazul de față, probele care conțin sânge într-un procent mai mare, pot inhiba reacția PCR. De asemenea, prezența mucusului cervical nu interferă cu rezultatele testului.